本发明公开了一种超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒及其构建方法,本发明还公开了应用元件盒构建超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器的方法,涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性致癌物的监测。将该生物传感器元件盒应用于复合DNA损伤超敏感型七基因缺失面包酵母突变株中,可提高该生物传感器元件盒的检测灵敏性。因此,与现有技术相比,本发明具有对遗传毒性致癌物检测灵敏度高、适用于环境中低剂量存在的化学致癌物的检测、对环境污染物的检测范围广,操作简便等优点。该生物传感器的发明可促进环境有害物质实时监测平台的建立。
1.超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器,其特征在于,该生物传感器构建方法包含下列步骤:a、敲除五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5中MAG1和RAD1基因,获得复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δmag1Δrad1,步骤如下:a1、将质粒Δmag1::hisG-URA3-hisG用限制性内切酶EcoRI和BgalII进行酶切,得到敲除组件mag1Δ::hisG-URA3-hisG;a2、将敲除组件用醋酸锂转化方法转入五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母中,发生同源重组,通过SD-Ura选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株;a3、将质粒Δrad1::Blast用限制性内切酶SalI进行酶切,得到敲除组件rad1Δ::hisG-URA3-hisG,将敲除组件用醋酸锂转化方法转入六基因缺失的面包酵母突变株中,发生同源重组,通过SD-Ura选择性平板筛选得到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株,该突变株即为缺失yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ七个基因的面包酵母;b、构建HUG1-yEGFP-CYC1基因片段,步骤如下:(1)从野生面包酵母中提取基因组DNA1a、取野生面包酵母,接种于YPD培养液中,在30°C,200转/分钟的条件下,振荡培养16小时,得到野生面包酵母菌液;其中:YPD培养液的配方重量百分比为:酵母膏1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,余者为水;1b、取野生面包酵母菌液1.5毫升,用4000转/分钟离心2分钟,取沉淀物悬于200微升提取缓冲液中;其中:提取缓冲液的配方为:曲拉通X-1002%,十二烷基磺酸钠1%,氯化钠0.1摩尔,乙二胺四乙酸1毫摩尔,三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔,余者为水,pH8.0;1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿,震荡3分钟后,以12000转/分钟离心10分钟,取上层液体;1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇,在-20°C静置30分钟,以12000转/分钟离心15分钟,去上清,取沉淀物;1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水,即为野生酵母基因组DNA;(2)、扩增HUG1启动子基因片段野生面包酵母基因组作为扩增模板,通过上游引物HUG1Pro-1:5’AAxa0CTGxa0CAGxa0GCAxa0AAAxa0ACTxa0AGAxa0GCCxa0AAGxa0CC3’和下游引物HUG1Pro-2:5’TTAxa0GACxa0ATAxa0TAGxa0TTTxa0TTTxa0TTTxa0ATTxa0GCTxa0G3’,利用PCR技术,扩增得到HUG1启动子基因片段;(3)、扩增yEGFP编码区基因片段以及终止子CYC1基因片段质粒PUG36作为扩增模板,通过上游引物yEGFP-1:5’AAAxa0ACTxa0ATAxa0TGTxa0CTAxa0AAGxa0GTGxa0AAGxa0AATxa0T3’和下游引物yEGFP-2:5’TACxa0ATGxa0ACTxa0TTGxa0TACxa0AATxa0TCAxa0TCCxa0ATAxa0C3’,利用PCR技术,扩增得到yEGFP编码区基因片段;质粒PUG36作为扩增模板,通过上游引物CYC1-1:5’TGTxa0ACAxa0AAGxa0TCAxa0TGTxa0AATxa0TAGxa0TTAxa0TGTxa0C3’和下游引物CYC1-2:5’TCCGxa0GAAxa0TTCxa0GGTxa0ACCxa0GGCxa0CGCxa0AAAxa0TTAxa0AAG3’,扩增得到终止子CYC1基因片段;(4)、将上述HUG1启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段和终止子CYC1基因片段按摩尔比1:1:1的比例作为扩增模板,通过上游引物HUG1Pro-1:5’AAxa0CTGxa0CAGxa0GCAxa0AAAxa0ACTxa0AGAxa0GCCxa0AAGxa0CC3’和下游引物CYC1Pro-2:5’TCCGxa0GAAxa0TTCxa0GGTxa0ACCxa0GGCxa0CGCxa0AAAxa0TTAxa0AAG3’,扩增得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒,即基于酵母DNA损伤响应的HUG1-yEGFP-CYC1基因片段;上述PCR的条件为:94°C5分钟;94°C45秒,55°C45秒,72°C1分钟,30个循环;72°C5分钟;(5)将HUG1-yEGFP-CYC1基因片段克隆到pBluescipt载体上,利用PstI内切酶和EcoR1内切酶酶切,然后进行连接,得到克隆子pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1;(6)、将克隆子pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1用BamH1内切酶和EcoR1内切酶进行酶切,得到两端酶切位点为BamH1和EcoR1的基因片段,再克隆到pM4366载体中,用Not1内切酶切下片段HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO;(7)、将HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO片段用醋酸锂转化方法转入复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中,通过SD-Ura选择性平板筛选得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株。技术领域
本发明涉及生物技术,尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境化学污染物的监测。
背景技术
面包酵母是一种简单真核生物,单细胞,遗传改造操作简单,培养简便快速且环境友好,适合作为一种模式生物应用于生命科学研究中。目前在环境污染检测技术领域中,面包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视,一些以面包酵母为模式生物的检测系统得到了发展。遗传毒性致癌物是指能与DNA反应,引起DNA损伤而致癌的化学致癌物,可用生物化学试验或间接地应用遗传毒性试验方法来鉴定遗传毒性致癌物,包括直接致癌物、间接致癌物及某些无机致癌物。现已发展了多个基于DNA损伤转录响应的遗传毒性致癌物的检测体系,面对高通量,实时监测的现实要求,我们仍需继续创新,开发高灵敏,高应用性的生物传感器。构建一个遗传毒性致癌物生物传感器,除了宿主细胞外,还需具备以下两个基本元件:感应元件和连接于此后的报告元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应,并开启后者的表达,从而产生可检测出的信号。本发明将这两个元件组合在一起的基因片段称为生物传感器元件盒。HUG1(hydroxyureaxa0andxa0UVxa0andxa0gammaxa0radiationxa0induced)可因细胞被羟基脲(hydroxyurea)处理后有显著性上调表达,因而被视为当细胞受到DNA损伤及复制停滞后可起到转录响应的潜在基因。经研究显示HUG1基因受到MEC1通路上的基因转录调控。在面包酵母中,MEC1是磷脂酰肌醇3-激酶家族成员之一,是一个重要的检验点基因(checkpointxa0gene),检验点基因可转录诱导大量调节子基因(regulonxa0gene)来启动DNA修复,致使细胞周期阻滞,缓解DNA损伤。而研究人员发现存在于MEC1检验点信号通路中的基因在遇到复制阻滞及DNA损伤均可转录响应诱导HUG1的表达。已有报道证明HUG1在一般条件下的表达量很低,但确实受DNA损伤信号的显著诱导,且灵敏度高,可用作制备生物传感器的感应元件。绿色荧光蛋白(GFP)是从水母中分离出的天然生物发光蛋白;其性质极其稳定;无需添加任何底物及辅助因子,即在紫外或蓝光的激发下发出绿色荧光。它在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能发出荧光,具有活体、原位、实时表达的特点。而酵母增强型绿色荧光蛋白(yEGFP)是一种密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白,它可在酵母细胞中增强表达。对比此前广泛使用的编码B-gal半乳糖苷酶的报告基因lacZ,GFP具有直接用于活体细胞检测,并可克服利用酶作为报告基因的一系列缺点(破坏酵母细胞壁,影响酶活显色的因素复杂等),检测手段多样、自动化等一系列优点,利用绿色荧光蛋白作为制备生物传感器的效应元件,使得环境中遗传毒性化合物测评体系更有利地向高通量,快速,便捷的阶段发展。利用SOE法(Genexa0Splicingxa0byxa0Overlapxa0Extension)进行PCR基因片段拼接,即通过PCR过程中基因片段的交错延伸实现拼接。该方法是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,该技术使用简易。由于引物只需要与模板有效结合,尤其是5’端序列不必与模板完全配对,因此扩增引物的5’端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆。流式细胞技术是分析细胞中的一个重要领域,该技术为细胞学研究手段之一,能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个细胞个体的分析,而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式)测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较,具有速度快,精度高,准确性好的特点。
发明内容
本发明的目的是,首先提供一种超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1及其构建方法,并将生物传感器元件盒应用于复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中,得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器,该生物传感器大大提高了对检测环境中遗传毒性化学物质的敏感性,扩大了检测范围,增强检测手段的灵活性。为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:一、超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1基因片段的构建方法为:1、提取野生面包酵母基因组DNA,通过特异性引物,以野生面包酵母基因组DNA为模板,PCR扩增得到HUG1启动子基因片段;2、提取质粒PUG36,通过特异性引物,以PUG36质粒DNA为扩增模板,PCR扩增分别得到yEGFP编码区基因片段;3、提取质粒PUG36,通过特异性引物,以PUG36质粒DNA为扩增模板,PCR扩增分别得到终止子CYC1基因片段;4、利用SOE法,通过特异性引物,以HUG1启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段、终止子CYC1基因片段按照摩尔比1:1:1的比例为扩增模板,PCR扩增得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1基因片段;二、超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒转入复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中,应用于遗传毒性致癌物的检测:1、将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1转入到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中,形成超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5ΔradΔmag1Δ-HUG1-yEGFP-CYC1;其中复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株是在对氧化损伤高敏感性的五基因缺失面包酵母突变株(专利申请号:2010105941713)的基础上,敲除与DNA损伤修复有关的MAG1和RAD1基因,获得缺失yap1cwp1cwp2snq2pdr5rad1mag1七基因的面包酵母突变株。2、超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器可利用流式细胞仪技术,通过测定绿色荧光蛋白表达的变化情况从而对遗传毒性致癌物进行检测。本发明的优点与效果:超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1关键性优点在于,它对遗传毒性致癌物有较高的灵敏性,检测操作简便,人为误差减小,也可用于直接检测,具有实现大批量乃至高通量的遗传毒性化合物实时监测的应用潜力。与宿主为野生型面包酵母相比,本发明中宿主为复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株的超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器,对各类型遗传毒性致癌物的敏感度均有提高,对于甲磺酸甲酯(MMS)在极低浓度下(25ppm)的检测灵敏度提高50多倍(图1);对过氧化氢(H₂O₂)在0.6mM浓度的检测灵敏度提高10多倍;对大分子致DNA损伤化合物腐草霉素(Phleomycin)在2.5μg/ml浓度的检测灵敏度提高40倍;宿主为野生型面包酵母的遗传毒性致癌物生物传感器,不能检测到叔丁基过氧化氢(t-BHP)及DNA损伤剂4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)甲基紫精(methylxa0viologen)引起的DNA损伤信号,而超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器均可检测到这两种致DNA氧化损伤化合物,并且有较高的检测灵敏度(表1)。因此超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器的应用可提高其检测灵敏度并扩大其检测范围,更能促进环境遗传毒性致癌物的实时监测平台的建立。表1、超敏感型面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器与四种现有的面包酵母遗传毒性致癌物生物传感器灵敏度的比较分析。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表中所示数值为诱导表达倍数,表示检测得到的信号强度,与空白对照的检测信号强度之间相除后的检测结果;无检测表示没有进行检测。
附图说明
图1、遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1应用于不同面包酵母株中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)检测灵敏度的比较。图中横坐标表示DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的浓度;纵坐标表示生物传感器对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)检测所得到的相对荧光强度诱导倍数;—●—曲线表示遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1应用于野生型面包酵母中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的检测结果;ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="176"/>曲线表示于遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1应用于复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的检测结果。
具体实施方式
一、超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒的构建方法包含下列步骤:(1)、从野生面包酵母中提取基因组DNA:1a、取野生面包酵母,接种于YPD培养液中,在30°C,200转/分钟的条件下,振荡培养16小时,得到野生面包酵母菌液;其中:YPD培养液的配方重量百分比为:酵母膏1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,余者为水;1b、取野生面包酵母菌液1.5毫升,用4000转/分钟离心2分钟,沉淀物悬于200微升提取缓冲液中;其中:提取缓冲液的配方为:曲拉通X-1002%,十二烷基磺酸钠1%,氯化钠0.1摩尔,乙二胺四乙酸1毫摩尔,三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔,余者为水,pH8.0;1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿,震荡3分钟后,以12000转/分钟离心10分钟,吸取上层液体;1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇,在-20°C静置30分钟,以12000转/分钟离心15分钟,去上清,取沉淀物;1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水,即为野生酵母基因组DNA;(2)、扩增HUG1启动子基因片段野生面包酵母基因组作为扩增模板,通过上游引物HUG1Pro-1:5’AAxa0CTGxa0CAGxa0GCAxa0AAAxa0ACTxa0AGAxa0GCCxa0AAGxa0CC3’和下游引物HUG1Pro-2:5’TTAxa0GACxa0ATAxa0TAGxa0TTTxa0TTTxa0TTTxa0ATTxa0GCTxa0G3’,利用PCR技术,扩增得到HUG1启动子基因片段(600bp)(3)、扩增yEGFP编码区基因片段以及终止子CYC1基因片段质粒PUG36(美国ATCC公司提供)作为扩增模板,通过上游引物yEGFP-1:5’AAAxa0ACTxa0ATAxa0TGTxa0CTAxa0AAGxa0GTGxa0AAGxa0AATxa0T3’和下游引物yEGFP-2:5’TACxa0ATGxa0ACTxa0TTGxa0TACxa0AATxa0TCAxa0TCCxa0ATAxa0C3’,利用PCR技术,扩增得到yEGFP编码区基因片段(750bp);质粒PUG36作为扩增模板,通过上游引物CYC1-1:5’TGTxa0ACAxa0AAGxa0TCAxa0TGTxa0AATxa0TAGxa0TTAxa0TGTxa0C3’和下游引物CYC1-2:5’TCCGxa0GAAxa0TTCxa0GGTxa0ACCxa0GGCxa0CGCxa0AAAxa0TTAxa0AAG3’,扩增得到终止子CYC1基因片段(260bp);(4)、扩增超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1基因片段将上述扩增得到的HUG1启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段和终止子CYC1基因片段按摩尔比1:1:1的比例作为扩增模板,通过上游引物HUG1Pro-1:5’AAxa0CTGxa0CAGxa0GCAxa0AAAxa0ACTxa0AGAxa0GCCxa0AAGxa0CC3’和下游引物CYC1Pro-2:5’TCCGxa0GAAxa0TTCxa0GGTxa0ACCxa0GGCxa0CGCxa0AAAxa0TTAxa0AAG3’,扩增得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒,即基于酵母DNA损伤响应的HUG1-yEGFP-CYC1基因片段;其中:PCR的条件为:94°C5分钟;94°C45秒,55°C45秒,72°C1分钟,30个循环;72°C5分钟。二、将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒应用于构建超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器,该方法包含下列步骤:(1)、在五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母(专利申请号为2010105941713)的基础上,再敲除与DNA损伤修复有关的MAG1和RAD1基因,获得复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株,步骤如下:1a、将质粒Δmag1::hisG-URA3-hisG(参考文献:Jinxa0Chen,etxa0al.(1990)Saccharomycesxa0cerevisiae3-methyladeninexa0DNAxa0glycosylasexa0hasxa0homologyxa0toxa0thexa0AlkAxa0glycosylasexa0ofxa0E.co1ixa0andxa0isxa0inducedxa0inxa0responsexa0toxa0DNAxa0alkylationxa0damage.Thexa0EMBOxa0Journal,vol.9,pp.4569-4575)用限制性内切酶EcoRxa0I和Bgalxa0II进行酶切,得到敲除组件mag1Δ::hisG-URA3-hisG;1b、将敲除组件用醋酸锂转化方法转入对氧化损伤高敏感性的面包酵母中,发生同源重组,通过SD-Ura选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株;1c、将质粒Δrad1::Blast(来源于Dr.E.Perkinsxa0NIESH,NC,USA)用限制性内切酶SalI进行酶切,得到敲除组件rad1Δ::hisG-URA3-hisG,将敲除组件用醋酸锂转化方法转入六基因缺失的面包酵母突变株中,发生同源重组,通过SD-Ura选择性平板筛选得到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株,该突变株即为缺失yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ七个基因的面包酵母;(2)将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒HUG1-yEGFP-CYC1基因片段克隆到pBluescipt载体(美国Thermo公司提供)上,利用PstI内切酶和EcoR1内切酶酶切进行连接,得到克隆pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1;(3)、将克隆pBluescipt-HUG1-yEGFP-CYC1用BamH1内切酶和EcoR1内切酶进行酶切,得到两端酶切位点为BamH1和EcoR1的酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统传感元件UG1-yEGFP-CYC1片段,再克隆到pM4366载体(参考文献:W.P.Voth,etxa0al.(2001)Yeastxa0vectorsxa0forxa0integrationxa0atxa0thexa0HOxa0locus.Nucleicxa0Acidsxa0Res.Vol.29,E59-9)中,用Not1内切酶切下片段HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO,;(4)、将HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO片段转入复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中,筛选得到超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器,上述转入与筛选方法包含下列步骤:4a、将复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株接种到1毫升YPD培养液,30°C,200转/分钟振荡条件下,培养16小时;4b、再加入YPD培养液2毫升,30°C,200转/分钟,培养4小时;4c、取1毫升4b中的酵母,以2500转/分钟离心2分钟,取沉淀物;4d、将沉淀物悬于100毫摩/升的400微升醋酸锂中,以2500转/分钟离心2分钟,取沉淀物;4e、将沉淀物悬于100毫摩/升的100微升醋酸锂中;4f、将2.0毫克/毫升的鲑鱼精单链DNA1微升煮沸5分钟,冰浴后与片段HO-hisG-URA3-hisG-HUG1-yEGFP-CYC1-HO0.1~1微克一起加入到步骤4e的醋酸锂中,室温放置5分钟;4g、再加入280微升浓度为50%的聚乙二醇4000;4h、振荡至混匀,30°C静置45分钟;4i、加入39微升二甲基亚砜,42°C热激5分钟;4j、4000转/分钟离心2分钟,取沉淀物,并将沉淀物悬于200微升无菌水中;4k、4000转/分钟离心2分钟,取沉淀物,悬于100微升无菌水中,然后再涂于SD-Ura营养缺陷型培养基平板,30°C培养箱中培养3天,生长出单菌落,该单菌落即超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株;其中SD-Ura选择性平板的配方为:酵母氮源无氨基酸无硫酸铵0.17%,硫酸铵0.5%,葡萄糖2%,腺嘌呤0.2%,色氨酸1%,组氨酸1%,亮氨酸1%,赖氨酸1%,琼脂粉2%,余者为水;三、超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器用于检测遗传毒性致癌物的方法,该方法包含下列步骤:1、将超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株接种于YPD培养液中,30°C,200转/分钟下振荡培养16小时;2、将过夜培养的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株菌液用新鲜的YPD选择性培养液稀释到细胞密度OD₆₀₀为0.1;3、取1毫升稀释后的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株菌液,加入DNA损伤烷化剂甲基磺酸甲酯,培养8小时;4、取200微升超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株菌液,4000转/分钟离心2分钟,弃上清,取沉淀物;加入200微升0.1MPBS溶液,悬浮沉淀物;再次4000转/分钟离心2分钟,弃上清,取沉淀物;加入500微升0.1MPBS溶液,悬浮沉淀物;其中0.1MPBS溶液配方为:称取8克氯化钠,0.2克氯化钾,3.68克十二合磷酸一氢钠,0.24克磷酸二氢钾,溶于双蒸水中,用氢氧化钠调节pH值为7.4,定容至1升;5、加入1毫克每毫升的溴化丙啶(PI)溶液3微升,混匀,置于冰上,黑暗保存直至使用流式细胞仪进行检测;6、用流式细胞仪对样品进行检测,同时设定FITC及PE两激光通道;7、用Flowxa0Jo流式数据分析软件输出分析数据,数据中的Mean值即检测样品的平均荧光强度数值;8、按照步骤1至步骤7的方法测定未经甲基磺酸甲酯处理的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株平均荧光强度数值,作为空白对照;9、当经甲基磺酸甲酯处理的超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器酵母株溶液平均荧光强度数值与空白对照的平均荧光强度数值之比大于2时表明检出DNA损伤信号。<110>xa0xa0中国科学院水生生物研究所xa0首都师范大学xa0<120>xa0xa0超敏感型酵母遗传毒性致癌物生物传感器元件盒及其应用xa0xa0<140>xa0xa02012102633029<141>xa0xa02012-07-27xa0<160>xa0xa08xa0xa0xa0xa0xa0<210>xa0xa01<211>xa0xa028<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa01xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0AACTGCAGGCAAAAACTAGAGCCAAGCCxa0<210>xa0xa02<211>xa0xa028<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa02xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0TTAGACATATAGTTTTTTTTTATTGCTGxa0<210>xa0xa03<211>xa0xa028<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa03xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0AAAACTATATGTCTAAAGGTGAAGAATTxa0<210>xa0xa04<211>xa0xa028<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa04xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0TACATGACTTTGTACAATTCATCCATACxa0xa0<210>xa0xa05<211>xa0xa028<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa05xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0TGTACAAAGTCATGTAATTAGTTATGTCxa0<210>xa0xa06<211>xa0xa031<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa06xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0TCCGGAATTCGGTACCGGCCGCAAATTAAAGxa0<210>xa0xa07<211>xa0xa028<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220>xa0<400>xa0xa07xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0AACTGCAGGCAAAAACTAGAGCCAAGCCxa0<210>xa0xa08<211>xa0xa031<212>xa0xa0DNA<213>xa0xa0人工序列<220><400>xa0xa08xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0TCCGGAATTCGGTACCGGCCGCAAATTAAAG